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May 20, 2024

La eficacia del cloro.

npj Clean Water volumen 4, Número de artículo: 48 (2021) Citar este artículo 6666 Accesos 7 Citas 8 Detalles de Altmetric Metrics Las soluciones de cloro se utilizan ampliamente para la producción de productos biológicos.

npj Clean Water volumen 4, Número de artículo: 48 (2021) Citar este artículo

6666 Accesos

7 citas

8 altmétrico

Detalles de métricas

Las soluciones de cloro se utilizan ampliamente para la producción de agua potable biológicamente segura. La capacidad de los sistemas de tratamiento de agua potable en el punto de uso [POU] ha ganado interés en lugares donde los sistemas de tratamiento centralizados y las redes de distribución no son prácticos. Este estudio investigó la actividad antimicrobiana y antibiopelícula de tres desinfectantes a base de cloro (iones de hipoclorito [OCl-], ácido hipocloroso [HOCl] y soluciones activadas electroquímicamente [ECAS]) para su uso en aplicaciones de agua potable en puntos de uso. La actividad antimicrobiana relativa se comparó en ensayos de suspensión bactericida (BS EN 1040 y BS EN 1276) utilizando Escherichia coli. La actividad anti-biopelícula se comparó utilizando Pseudomonas aeruginosa sésil establecida dentro de un reactor de biopelícula del Centro para el Control de Enfermedades [CDC]. El HOCl exhibió la mayor actividad antimicrobiana contra E. coli planctónica a >50 mg L-1 de cloro libre, en presencia de carga orgánica (albúmina sérica bovina). Sin embargo, ECAS exhibió una actividad anti-biopelícula significativamente mayor en comparación con OCl- y HOCl contra biopelículas de P. aeruginosa con ≥50 mg L-1 de cloro libre. Con base en esta evidencia, los desinfectantes donde HOCl es la especie de cloro dominante (HOCl y ECAS) serían desinfectantes alternativos apropiados a base de cloro para aplicaciones de agua potable en puntos de uso.

Una fuente importante de enfermedades humanas es el consumo de agua biológicamente contaminada1. Esto es especialmente relevante para los países de bajos ingresos (es decir, el ingreso nacional bruto [INB] per cápita es <$1025) y los países menos desarrollados (46 países de bajos ingresos que enfrentan graves impedimentos estructurales para el desarrollo sostenible) donde se estima que el 30% de la población, en promedio, tener acceso a servicios básicos de saneamiento2. Esto contrasta con los países de ingresos medios-altos (INB per cápita entre 4.036 y 12.475 dólares) y altos (INB per cápita > 12.476 dólares) que utilizan predominantemente sistemas centralizados de tratamiento de agua potable para garantizar la producción y el suministro de agua biológicamente segura3. La función principal de la desinfección del agua potable es controlar los microorganismos patógenos y garantizar que el agua tratada sea biológicamente segura para beber. El cloro, en forma de hipoclorito de sodio [NaOCl], es el desinfectante más común debido a su bajo costo y sus efectivas propiedades antimicrobianas4. La presencia de cloro residual (0,5 a 5 mg L-1) dentro de las redes de redistribución limita el nuevo crecimiento microbiano, lo que ayuda a mantener agua biológicamente segura en el punto de entrega3. Se monitorean organismos indicadores como Escherichia coli, coliformes totales, Enterococos y Clostridium perfingens3,5, que infieren la presencia de materia fecal, para asegurar la efectividad de los procesos de tratamiento de desinfección. El límite recomendado para estos organismos indicadores en el agua tratada es cero UFC 100 mL-1, debido a su potencial naturaleza patógena3,5. Lamentablemente, el uso de desinfectantes con cloro da lugar a la formación de subproductos de la desinfección [DBP]6,7 como los trihalometanos8 y los ácidos haloacéticos9. Se sabe que estos subproductos presentan propiedades mutagénicas y cancerígenas10 y, por tanto, son muy indeseables.

Point-of-use [POU] drinking water treatment systems do not require distribution networks and therefore negate the need to maintain residual chlorine levels. The World Health Organization recommends free chlorine concentrations of between 0.2 and 0.5 mg L−1 at point of delivery and use3. The use of conventional chlorine-based disinfectants, such as hypochlorite (OCl-), within POU water disinfection requires the storage and transportation of hazardous chemicals and can also cause the formation of harmful DBPs and the deterioration of taste and odour11. Ultraviolet and ozone are well established as disinfection technologies within both decentralised/POU12,13 and large scale drinking water treatment14,3.3.CO;2-1." href="/articles/s41545-021-00139-w#ref-CR15" id="ref-link-section-d367130989e520"> 15, pero un beneficio adicional de implementar soluciones activadas electroquímicamente [ECAS] es que tiene la capacidad de usarse externamente a sistemas de tratamiento de agua como parte de la producción de alimentos16,17 o en entornos de atención médica18,19. Un número limitado de estudios ha comparado el ECAS con agentes de cloro comúnmente utilizados para aplicaciones de desinfección descentralizadas20,21. Aunque estos estudios preliminares fueron prometedores, ninguno de los estudios informó sobre el pH de los ECAS estudiados ni sobre su eficacia contra las biopelículas.

Las tecnologías de desinfección electroquímica están surgiendo en el sector del agua8,22 y actualmente están bien establecidas en el sector alimentario16,17 y, en menor medida, en entornos clínicos/sanitarios18,19. La generación de ECAS se ha descrito previamente en detalle19 y se genera haciendo pasar una solución salina a través de una celda electroquímica con compartimentos anódico y catódico separados. Las soluciones anódicas son altamente oxidantes con valores de potencial de oxidación-reducción [ORP] superiores a +1000 mV23,24. Con estos valores de ORP, las soluciones anódicas son de naturaleza ácida (pH entre 2 y 5) como resultado de especies antimicrobianas oxidativas transitorias (metaestables) que se forman en la superficie del ánodo. A valores de pH ácidos, las principales especies químicas antimicrobianas están dominadas por el ácido hipocloroso [HOCl] (>95%) y el cloro disuelto [Cl2] (<5%)25,26. Especies antimicrobianas metaestables adicionales que incluyen; También se teoriza que se generan OH-, O3, H2O2 y O2-, aunque se debate su vida útil y actividad dentro de las soluciones activas27,28. Las propiedades antimicrobianas de ECAS resultan de una combinación de HOCl y las especies metaestables que dan lugar a los altos valores de ORP observados. El modo de acción de tales soluciones es entonces la ruptura física de las membranas celulares internas y externas19,29, lo que lleva a la alteración y falla de la funcionalidad microbiana, como los mecanismos de generación de energía23.

En lugar de existir en estado planctónico, ahora se entiende que la mayoría de los microorganismos se adhieren a superficies o sustratos y establecen comunidades sésiles conocidas como biopelículas30,31. Las biopelículas naturales contienen microorganismos de múltiples especies, incluidas bacterias, algas, hongos y protozoos, encerrados en una sustancia polimérica extracelular [EPS]32,33 como una adaptación para proteger contra el estrés externo, como los desinfectantes, incluido el cloro. La presencia de biopelículas dentro de los sistemas de tratamiento de agua potable se considera un área de preocupación para mantener la calidad del agua34,35. La formación de biopelículas en infraestructuras, como tuberías y filtros, da como resultado una bioincrustación que puede reducir el tiempo operativo y provocar la corrosión de los materiales36,37. En particular, se sabe que las biopelículas actúan como reservorios de patógenos38, mediante el desprendimiento de células hijas en suministros de agua a granel. Los patógenos transmitidos por el agua a menudo se derivan de la contaminación fecal (p. ej., E. coli O157:H7) y pueden provocar enfermedades gastrointestinales [GI] potencialmente mortales si no se tratan; además, los patógenos oportunistas (p. ej., especies de Campylobacter, especies de Legionella y Pseudomonas aeruginosa) pueden provocar enfermedades respiratorias. o infecciones y enfermedades gastrointestinales38. Es cada vez más preocupante la susceptibilidad cada vez menor de las bacterias dentro de las biopelículas a los antimicrobianos. La evidencia ha revelado que las especies reactivas de cloro, por ejemplo, OCl-, no pueden penetrar la matriz polimérica extracelular de las biopelículas lo suficiente como para ejercer una acción biocida efectiva39,40.

El objetivo principal de este estudio fue investigar la actividad antimicrobiana y la inhibición de biopelículas de OCl-, HOCl y ECAS para su uso en sistemas de agua potable POU. Las actividades bactericidas de OCl-, HOCl y ECAS se compararon mediante ensayos de desinfección química estándar utilizando Escherichia coli como organismo patógeno modelo, en el contexto de la reducción de la carga microbiana en agua a granel. Además, este estudio también investigó la eficacia de OCl-, HOCl y ECAS para reducir la densidad de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa establecidas.

La actividad antimicrobiana de los tres desinfectantes de prueba contra E. coli ATCC 10536 se evaluó utilizando los métodos bactericidas estándar BS EN 1040 y 127641,42. Dentro de ambos métodos, una reducción de 5 log del organismo objetivo es el umbral mínimo requerido para definir que el producto tiene actividad bactericida, según lo definido por los parámetros experimentales, ya sea en presencia (BS EN 1276) o ausencia (BS EN 1040). de una carga orgánica. Esto requiere un inóculo inicial mayor (8,54 ± 0,27 log10 UFC mL-1) de lo que se esperaría de E. coli presente en las aguas de entrada para los sistemas de tratamiento de agua potable POU (~2,06 ± 1,91 log10 UFC 100 mL-1)43.

La Figura 1 muestra la actividad antimicrobiana de OCl-, HOCl y ECAS contra E. coli sin carga orgánica (BS EN 1040) presente. En concentraciones de cloro libre (FC) ≥50 mg L-1, todos los desinfectantes lograron la reducción logarítmica requerida (5 log UFC mL-1) en las condiciones del ensayo41. A una concentración de FC de 25 mg L-1, OCl- exhibió una actividad antimicrobiana significativamente reducida en comparación con ECAS y HOCl (p <0,0001). Para OCl-, se observó una reducción de 3,80 ± 1,246 log10 UFC mL-1, que está muy por debajo de la reducción de 5 log requerida para definir que un producto tiene actividad bactericida, según lo definido por las condiciones del ensayo realizado. A esta misma concentración (25 mg L-1 FC), HOCl resultó en una reducción logarítmica completa (7,366 ± 0,048 log10 UFC mL-1), mientras que ECAS resultó en una reducción de 5,676 ± 0,807 log10 UFC mL-1. La Tabla 1 muestra los valores de CT para una reducción de 5 log de E. coli para NaOCl, HOCl y ECAS. Los valores CT son el producto de la concentración de un desinfectante (por ejemplo, cloro activo libre) y el tiempo de contacto con el agua que se está desinfectando. El valor CT de HOCl (16,51 mg min L-1) fue menor que el de ECAS (21,98 mg min L-1), y aproximadamente la mitad que el de NaOCl (33,81 mg min L-1), cuando no hay solución inhibidora presente. Estos valores de CT indican que ECAS y OCl- requieren mayores concentraciones de FC o tiempo de contacto para una reducción logarítmica equivalente, en comparación con HOCl.

Eficacia antimicrobiana de NaOCl [negro], ECAS [gris] y HOCl [blanco] utilizando concentraciones de cloro libre estandarizadas contra E. coli ATCC 10536, y evaluada utilizando BS EN 1040 (41British Standards Institution, 2005a). La línea de puntos representa la reducción logarítmica mínima (5 log UFC ml-1) necesaria para demostrar actividad bactericida básica en las condiciones experimentales del ensayo (n = 3 ± desviación estándar [sd]). Diferencias significativas (valores p) calculadas mediante un ANOVA de dos vías con el post-test de comparación de Tukey, con un intervalo de confianza del 95% (****p < 0,0001; ***p < 0,001). ND = no detectado. Las barras de error representan la desviación estándar.

La Figura 2 muestra la actividad antimicrobiana de los tres desinfectantes en presencia de una baja concentración de carga orgánica que interfiere (limpia) (0,3 g L-1 de albúmina sérica bovina [BSA]). La concentración más alta de FC probada (150 mg L-1) resultó en reducciones logarítmicas completas para NaOCl (7,30 ± 0,019 log10 CFU mL-1) y HOCl (7,30 ± 0,072 log10 CFU mL-1), mientras que ECAS resultó en una reducción de 6,96 ± Reducción de 1,536 log10 UFC mL-1. Por lo tanto, todos los desinfectantes demostraron actividad bactericida en presencia de una carga orgánica según las condiciones de la prueba (BS EN 1276). Con 100 mg L-1 FC, todos los desinfectantes exhibieron un efecto antimicrobiano significativo (reducción >5 log) y no hubo diferencias significativas entre los tres desinfectantes, por lo que HOCl resultó en una reducción logarítmica completa, para OCl, una reducción logarítmica de 7,871. Se logró ± 0,74 log10 UFC mL-1, mientras que ECAS logró una reducción de 6,806 ± 1,09 log10 UFC mL-1. A 50 mg L-1 FC, OCl- no logró la reducción de 5 log requerida (4,531 ± 0,15 log10 UFC mL-1), lo que resultó en una actividad antimicrobiana significativamente menor en comparación con HOCl y ECAS (p <0,0001), por lo que no hubo No hubo diferencias significativas entre el tratamiento con HOCl y ECAS (p > 0,05). En la concentración de FC más baja probada (25 mg L-1), ECAS fue el único desinfectante que redujo la carga bacteriana ≥5 log10 UFC mL-1 (Fig. 2), lo que resultó en una reducción logarítmica de 6,077 ± 1,441 log10 CFU mL-1. Las reducciones logarítmicas obtenidas para el tratamiento con OCl y HOCl fueron significativamente menores que las del ECAS (p < 0,001), por lo que el HOCl resultó en una reducción logarítmica de 3,207 ± 0,505 log10 UFC mL-1, que fue significativamente mayor que la de 1,945 ± 0,222 log10 UFC mL-1. −1 reducción logarítmica exhibida por OCl- (p = 0,0011). Los valores de CT de reducción de 5 log para OCl-, HOCl y ECAS con baja carga orgánica demostraron que NaOCl exhibió el valor de CT más alto (88,96 mg min L-1), seguido por HOCl (34,78 mg min L-1) y luego ECAS. (20,94 mg min L-1).

Eficacia antimicrobiana de NaOCl [negro], ECAS [gris] y HOCl [blanco] usando concentraciones estandarizadas de cloro libre contra E. coli ATCC 10536 con una solución de interferencia de 0,3 g L-1 BSA (42British Standards Institution, 2009). La línea de puntos representa la reducción logarítmica mínima (5 log UFC ml-1) necesaria para demostrar actividad bactericida básica en las condiciones experimentales del ensayo (n = 3 ± sd). Diferencias significativas (valores p) calculadas mediante un ANOVA de dos vías con el post-test de comparación de Tukey, con un intervalo de confianza del 95% (****p < 0,0001; ***p < 0,001; **p < 0,01) . ND = no detectado. Las barras de error representan la desviación estándar.

Cuando la concentración de la sustancia que interfiere se incrementó de 0,3 g L-1 (condiciones de BSA limpias) a 3,0 g L-1 (condiciones de BSA sucias) dentro del ensayo de prueba, hubo un impacto significativo en la actividad antimicrobiana exhibida por los tres desinfectantes (Fig. .3 y Tabla 1). La actividad antimicrobiana tanto de OCl- como de ECAS se redujo significativamente en comparación con los valores respectivos en condiciones limpias (p <0,0001) en todas las concentraciones de FC analizadas. El HOCl exhibió una actividad antimicrobiana significativamente mayor en comparación con el OCl- y el ECAS a 50, 100 y 150 mg L-1 FC (p <0,01), y el ECAS exhibió una actividad antimicrobiana significativamente mayor en comparación con el NaOCl (p <0,05). Esto se refleja en los valores de CT (Tabla 1), donde el valor de CT de reducción de 5 log para HOCl es 82,91 mg min L-1, mientras que los valores de CT no se pudieron calcular para NaOCl o ECAS en estas condiciones experimentales debido a una actividad antimicrobiana insuficiente. al final del tiempo de contacto de 5 minutos. En la concentración más baja de FC probada (25 mg L-1), no hubo diferencias significativas en la actividad antimicrobiana entre los tres desinfectantes probados (p > 0,05). Sin embargo, ECAS resultó en la mayor reducción logarítmica (1,606 ± 0,954 log10 CFU mL-1), seguido de HOCl (0,978 ± 0,202 log10 CFU mL-1) y OCl- (0,025 ± 0,004 log10 CFU mL-1). La carga orgánica probada en condiciones de suciedad no representa las concentraciones esperadas dentro de los sistemas de agua potable de POU. Sin embargo, los resultados resaltan la necesidad de reducir la materia orgánica presente para garantizar una actividad antimicrobiana suficiente durante las etapas de desinfección del tratamiento del agua potable.

Eficacia antimicrobiana de NaOCl [negro], ECAS [gris] y HOCl [blanco] usando concentraciones estandarizadas de cloro libre contra E. coli ATCC 10536 con una solución de interferencia de 3,0 g L-1 BSA (42British Standards Institution, 2009). La línea de puntos representa la reducción logarítmica mínima (5 log UFC ml-1) necesaria para demostrar actividad bactericida básica en las condiciones experimentales del ensayo (n = 3 ± sd). Diferencias significativas (valores p) calculadas mediante un ANOVA de dos vías con el post-test de comparación de Tukey, con un intervalo de confianza del 95% (****p < 0,0001; **p < 0,01; *p < 0,05). ND = no detectado. Las barras de error representan la desviación estándar.

La actividad antimicrobiana de OCl-, HOCl y ECAS se determinó contra biopelículas de Pseudomonas aeruginosa establecidas en cupones de policarbonato [PC] en función de la concentración de FC (Fig. 4). La densidad media de biopelícula recuperada de cupones de policarbonato de control no tratados (sin tratamiento desinfectante) fue de 8,45 ± 0,172 log10 cupón de UFC-1 (n = 18). Ninguno de los desinfectantes de prueba (OCl-, HOCl o ECAS) resultó en una reducción logarítmica completa en ninguna de las concentraciones de FC analizadas. A una concentración de FC de 150 mg L-1, la mayor reducción en la densidad de la biopelícula fue provocada por ECAS (3,852 ± 0,914 log10 UFC cupón-1), mientras que OCl- y HOCl exhibieron reducciones logarítmicas significativamente menores (p <0,0001) de 2,018 ± 0,393. cupón log10 UFC-1 y 2,005 ± 0,419 cupón log10 UFC-1, respectivamente. ECAS también exhibió una actividad antimicrobiana significativamente mayor en comparación con OCl- y HOCl a 100, 75 y 50 mg L-1 FC (p <0,01). Esto se refleja en los valores de CT para una reducción de 2 log (99%) en la densidad de la biopelícula (consulte la Tabla 1). El valor de CT para ECAS fue de 87,21 mg min L-1, mientras que los valores de CT para OCl- y HOCl no se pudieron determinar ya que no se logró una reducción de 2 log en ninguna de las concentraciones de FC analizadas. Sin embargo, a concentraciones de FC de 25 y 5 mg L-1, no hubo diferencia significativa en la actividad antimicrobiana exhibida por NaOCl, HOCl y ECAS (p > 0,05). De hecho, no hubo una reducción significativa en la densidad de la biopelícula entre 0 (control) y 5 mg L-1 FC (p > 0,05) para ningún desinfectante de prueba. En general, los resultados demuestran una dosis-respuesta de mayor eficacia antimicrobiana con concentraciones crecientes de FC. Curiosamente, para ECAS el mayor aumento en la actividad antimicrobiana (p = 0,009) ocurrió con ≥25 mg L-1 FC, mientras que los mayores aumentos para HOCl y OCl- se observaron entre 0 y 25 mg L-1 (p <0,0001).

Actividad antimicrobiana de NaOCl [△], HOCl [▢] y ECAS [○] utilizando concentraciones de FC estandarizadas contra biopelículas de Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 (n = 9 ± sd). [•••] Se refiere a la densidad media de biopelícula recuperada (cupón UFC-1) del tratamiento de control (sin tratar) (0 mg L-1); n = 18. Diferencias significativas (valores p) calculadas mediante un ANOVA de dos vías con el postest de comparación de Tukey, con un intervalo de confianza del 95% (****p < 0,0001; **p < 0,01). Las barras de error representan la desviación estándar.

Estudios anteriores han comparado la actividad antimicrobiana de desinfectantes comunes del agua potable, incluidos OCl-, dióxido de cloro, ozono y cloraminas en el contexto de redes centralizadas y de distribución44,45. Este estudio comparó directamente la actividad antimicrobiana de las soluciones OCl−, HOCl y ECAS con biopelículas planctónicas y bacterianas para posibles aplicaciones de agua potable en puntos de uso.

Los datos aquí presentados demuestran que todos los desinfectantes exhibieron una actividad antimicrobiana significativa contra E. coli planctónica en comparación con el control. En ausencia de sustancias inhibidoras (es decir, sin carga orgánica), todos los desinfectantes exhiben una dosis-respuesta antimicrobiana al aumentar las concentraciones de FC. En concentraciones de FC ≥50 mg L-1 no hubo diferencias significativas entre la actividad antimicrobiana de OCl-, HOCl o ECAS. Mientras que, a 25 mg L-1 FC, HOCl exhibió la mayor actividad antimicrobiana, seguido de OCl- y ECAS. Las diferencias observadas en la actividad antimicrobiana pueden explicarse por la diferente química de los desinfectantes de prueba. Los tres desinfectantes dan como resultado la producción de FC, y la química subyacente de la liberación depende de la formulación química y los parámetros fisicoquímicos (en particular, el pH), según lo dicta la ecuación de Nernst19. Por ejemplo, los mecanismos antimicrobianos (y por lo tanto la cinética) en los que se libera FC difieren entre NaOCl (hipoclorito de sodio) y NaDCC (dicloroisocianurato de sodio). La disolución de NaOCl (pH 11,4) da como resultado principalmente la formación de OCl-, mientras que la disolución de NaDCC (pH 5,6) da como resultado principalmente la formación de HOCl25,46. Para ECAS (pH 3,3), la disolución da como resultado una mezcla de especies de cloro; incluyendo HOCl y Cl2 disuelto, siendo HOCl la especie dominante. También se teoriza que se forman especies antimicrobianas metaestables adicionales28, lo que en consecuencia da como resultado que ECAS tenga el ORP más alto de los tres desinfectantes de prueba (+1134 mV). Los desinfectantes a base de cloro donde el OCl- es la especie de cloro dominante han demostrado ser menos eficaces, debido a la difusión ineficiente a través de la bicapa lipídica de las membranas celulares, por lo que la oxidación solo ocurre en la envoltura celular externa47. Por el contrario, el HOCl es capaz de penetrar a través de la envoltura exterior y difundir a través de la membrana plasmática interna como resultado de su neutralidad eléctrica47. Esto resulta en daño oxidativo interno a funciones celulares clave, como la generación de energía, así como daño al ADN bacteriano23,29.

Es bien conocido el impacto negativo de la carga orgánica sobre los desinfectantes oxidantes47,48. En este estudio, la presencia de material orgánico de baja concentración revela diferencias en las respuestas a la dosis que surgen de los diferentes mecanismos de acción exhibidos por OCl-, HOCl y ECAS. La vida media (DT50) de los iones OCl- se reduce en gran medida en varios órdenes de magnitud, de minutos a segundos49 y esto explica la reducción en la eficacia observada para el NaOCl incluso en condiciones limpias de BSA (Figs. 2, 3). Para HOCl, la actividad antimicrobiana se redujo significativamente a 25 mg L-1 FC en condiciones limpias de BSA, pero no a concentraciones >25 mg L-1 (es decir, 50, 100, 150 mg L-1). Curiosamente, no hubo diferencias significativas en la actividad antimicrobiana exhibida por ECAS a una concentración de FC de 25 mg L-1, ya sea en presencia o ausencia de una carga orgánica baja (condiciones limpias de BSA). Esto muestra que las bajas concentraciones de materia orgánica no interfieren indebidamente con el mecanismo de acción de ECAS en estas condiciones experimentales. ECAS exhibe un valor de ORP muy alto (>+1100 mV), debido a las especies reactivas de cloro y oxígeno, que a su vez impulsan reacciones de oxidación rápidas. Sin embargo, la presencia de concentraciones más altas de materia orgánica reducirá en última instancia el ORP a través de reacciones de oxidación-reducción50, contribuyendo a una reducción resultante en la actividad antimicrobiana de ECAS, como se ha observado anteriormente50,51. Curiosamente, trabajos previos de Robinson et al. en 201352 demostraron que la actividad antimicrobiana de ECAS podía mantenerse cuando se almacenaba durante un período de 398 días a 4 °C en la oscuridad, a pesar de no mostrar FC detectable después de 277 días (p. ej., < 0,01 mg L-1). Esto demuestra la importancia de que especies antimicrobianas adicionales, distintas de las derivadas del cloro, contribuyan a una mayor actividad antimicrobiana. Por lo tanto, ayuda a explicar la mayor actividad antimicrobiana de ECAS a una FC de 25 mg L-1 en presencia de condiciones limpias de BSA en comparación con soluciones equivalentes de HOCl y NaOCl. El aumento adicional de la carga orgánica de BSA (3,0 g L-1; condiciones sucias de BSA) dentro del ensayo bactericida redujo en gran medida la actividad antimicrobiana de OCl- y ECAS en todas las concentraciones de FC analizadas. En comparación, la actividad antimicrobiana del HOCl no se redujo significativamente en concentraciones de FC >25 mg L-1. Por lo tanto, está claro que el HOCl producido mediante la disolución de NaDCC demuestra una mayor actividad antimicrobiana contra las bacterias planctónicas en condiciones sucias de BSA. El HOCl derivado químicamente es más estable que las soluciones de HOCl generadas electroquímicamente, ya que no poseen especies antimicrobianas metaestables que se forman en la superficie anódica53. El HOCl derivado químicamente también se degrada a un ritmo más lento cuando se expone a la luz solar (UV)54, en comparación con el HOCl generado electroquímicamente que se degrada a un ritmo mayor55. Esto resalta la importancia de seleccionar el desinfectante más apropiado para su uso en los sistemas de tratamiento de POU. Por ejemplo, en los casos en los que la filtración o eliminación de materia orgánica del agua a granel no es una práctica estándar o es difícil, el HOCl proporcionaría una mayor eficacia antimicrobiana, en comparación con el NaOCl o el ECAS.

La reducción de la carga microbiana en aguas a granel también reducirá la formación de biopelículas en la infraestructura, así como también reducirá potencialmente la densidad de las biopelículas establecidas. Por lo tanto, también se determinó la actividad antimicrobiana comparativa de OCl-, HOCl y ECAS frente a biopelículas de Pseudomonas aeruginosa establecidas en cupones de policarbonato. Se observaron reducciones equivalentes en la densidad de la biopelícula (y los valores de CT) para OCl- y HOCl en todas las concentraciones de FC analizadas. ECAS fue el desinfectante más eficaz probado, mostrando un valor de CT de 87,21 mg min L-1; en comparación, los valores de CT no se pudieron calcular para OCl- y HOCl ya que no se logró una reducción de 2 log para ninguna de las concentraciones de FC analizadas. Se ha demostrado que los desinfectantes antimicrobianos que contienen especies halógenas como el cloro tienen una eficacia disminuida para reducir la densidad celular de la biopelícula, como resultado de las interacciones de reacción-difusión y adsorción con sustancias de la matriz de EPS39,56. La alta reactividad del OCl- contribuye a su ineficiencia contra las biopelículas microbianas, ya que se neutraliza rápidamente mediante la reacción con la matriz de EPS, lo que reduce su penetración y, por lo tanto, la difusión hacia las células bacterianas dentro de las biopelículas40. Por lo tanto, se reduce la concentración de especies halógenas disponibles para reaccionar con los microorganismos objetivo, aumentando así los valores de CT40,57. Stewart y Rayner et al. (2001)40 estimaron que el OCl- era 767 veces más lento a la hora de reducir una biopelícula de P. aeruginosa en 9,9 log10 UFC cm-2 en comparación con un estado planctónico equivalente.

Los desinfectantes probados contra biopelículas en este estudio demuestran una dosis-respuesta antimicrobiana con concentraciones crecientes de FC. Las curvas dosis-respuesta para OCl- y HOCl no difirieron significativamente, mientras que ECAS demostró una actividad anti-biopelícula significativamente mayor en concentraciones de FC ≥50 mg L-1 en comparación con NaOCl y HOCl (p ≤ 0,0021). En contraste, contra las células planctónicas, el HOCl demostró la mayor actividad antimicrobiana en concentraciones de FC ≥50 mg L-1 (Figs. 1-3). Esta actividad antimicrobiana reducida observada de OCl− y HOCl contra biopelículas está de acuerdo con estudios previos, según los cuales los valores de CT y los factores de tolerancia son 10 o 100 veces mayores entre la desinfección planctónica y de biopelículas40,47. Tanto el OCl- como el HOCl se neutralizan mediante la reacción con biopelículas EPS, debido a su alta reactividad40. Por el contrario, se ha observado que ECAS tiene una actividad antibiopelícula significativa51,58. Ayebah et al.51 determinaron las propiedades antibiopelículas del agua electrolizada ácida [EW] contra biopelículas de Listeria monocytogenes, lo que dio como resultado una reducción de 4,5 log10 después de tiempos de contacto de 30 y 60 s. El modo de acción antimicrobiano postulado para ECAS contra biopelículas microbianas es doble. El alto ORP (en relación con HOCl y OCl-), indicativo de su mayor capacidad de oxidación y especies antimicrobianas metaestables4,28 altera la barrera protectora de EPS, que está compuesta por una mezcla compleja de polisacáridos, proteínas y ADN59, mediante la destrucción de enlaces covalentes. dentro del ADN, ARN y proteínas60,61. Además, las especies de cloro activo dentro de ECAS, predominantemente HOCl, no tienen carga y, por lo tanto, pueden penetrar a través del EPS y reaccionar con las células bacterianas incrustadas47.

En general, este estudio investigó la actividad antimicrobiana y antibiopelícula cuantitativa de tres desinfectantes a base de cloro contra bacterias planctónicas y sésiles (biopelículas) de una sola especie para posibles aplicaciones de agua potable en puntos de uso. Según estos datos, se demostró que el OCl- era el menos eficaz contra las poblaciones de bacterias planctónicas y sésiles, se descubrió que el HOCl era el más eficaz para reducir (desinfectar) las poblaciones de bacterias planctónicas y el ECAS era el más eficaz para reducir la densidad de bacterias establecidas. biopelículas. Vale la pena señalar que las comparaciones directas entre la eficacia de OCl-, HOCl y ECAS entre la desinfección de poblaciones planctónicas de E. coli y la reducción de la densidad de la biopelícula de P. aeruginosa deben realizarse con precaución. No se llevó a cabo la desinfección de P. aeruginosa planctónica, ya que no se incluye como parte del análisis estándar del agua potable, debido a la opinión de que es un patógeno oportunista. Por el contrario, no se investigó la reducción de la densidad de las biopelículas de E. coli, ya que no se sabe bien que forme biopelículas, a diferencia de P. aeruginosa. Anteriormente se ha demostrado que la interacción de HOCl y ECAS con materia orgánica (p. ej., ácidos húmicos) no da como resultado la producción de altas concentraciones de subproductos de desinfección, específicamente trihalometanos, a diferencia de OCl-8. Por lo tanto, en los sistemas POU donde se elimina la materia orgánica La materia mediante filtración o coagulación no es una práctica común ni posible, la implementación de HOCl o ECAS no solo reducirá eficazmente la carga microbiana en las aguas de suministro y ayudará a gestionar la formación de biopelículas, sino que también minimizará la formación de THM, asegurando la producción de sustancias biológica y químicamente. agua potable segura. Sin embargo, el HOCl se puede producir químicamente mediante la disolución de NaDCC (como se muestra en este estudio), pero también se puede generar electroquímicamente62. La capacidad de producir desinfectantes eficaces in situ y bajo demanda minimiza la necesidad de transportar y almacenar productos químicos peligrosos, reduciendo así la posibilidad de liberación accidental de productos químicos al medio ambiente. La naturaleza metaestable del HOCl (ácido o ligeramente ácido) generado electroquímicamente puede garantizar que el exceso de soluciones se pueda desactivar fácilmente mediante la exposición del material orgánico, ya que se relaja químicamente y vuelve a la solución salina original19. Se ha demostrado que el HOCl generado electroquímicamente es eficaz en una gran cantidad de entornos, incluidos los de producción de alimentos16,22 y entornos de atención médica19, lo que permite utilizar un desinfectante de manera segura en toda una comunidad, y no solo para aplicaciones de tratamiento de agua potable en puntos de uso, lo que no es posible con otras desinfecciones. tecnologías, como UV, ozono y carbón activado granular. El HOCl generado electroquímicamente podría proporcionar una actividad antimicrobiana superior junto con una mayor actividad anti-biopelícula (una consideración importante dentro de la infraestructura de tratamiento de agua potable de POU); sin embargo, su uso dentro de aplicaciones de POU requiere más investigación. Una limitación de este estudio es que las concentraciones de cloro libre residual no se controlaron después de los ensayos bactericidas o de reducción de biopelículas. Para garantizar que las concentraciones libres en los sistemas de tratamiento de agua potable POU no excedan las concentraciones requeridas por la OMS (0,2 a 0,5 mg L-1), los estudios futuros monitorearán la concentración de cloro residual después de ensayos bactericidas o de reducción de biopelículas.

Este estudio ha ayudado a avanzar en nuestra comprensión de los desinfectantes a base de cloro para aplicaciones de agua potable en puntos de uso. Sin embargo, las fuentes de agua que abastecen a los sistemas POU son mucho más complejas que las analizadas aquí, con una variedad de material orgánico y numerosas especies microbianas presentes, particularmente dado que las bacterias rara vez existen en comunidades de una sola especie en el medio ambiente63. Por lo tanto, se requiere investigar cultivos/biopelículas de múltiples especies, dentro de matrices más complejas como parte de sistemas modelo representativos, para mejorar nuestra comprensión de la actividad antimicrobiana y la idoneidad de los desinfectantes probados para aplicaciones en el tratamiento de agua potable en POU. Dichos modelos deben probar diferentes superficies de materiales que representen la variedad de sistemas de tratamiento de agua potable en el punto de uso (por ejemplo, tuberías o filtros) que podrían afectar la formación de biopelículas.

Se utilizaron tres desinfectantes a lo largo de este estudio: NaOCl, HOCl neutro ligeramente ácido y HOCl ácido generado electroquímicamente. La especie de cloro dominante presente en NaOCl fue OCl-, mientras que HOCl fue dominante tanto en las soluciones de HOCl neutras como en las ácidas. El HOCl ácido generado electroquímicamente se denominará solución activada electroquímicamente [ECAS]. Se prepararon soluciones madre de NaOCl diluyendo un blanqueador comercial (blanqueador Pattersons; Pattersons Ltd., Bristol, Reino Unido) en agua desionizada hasta una concentración final de cloro libre [FC] de 508 ± 18,19 mg L-1, con un pH medio de 11,4. ± 0,1 y un ORP medio de +588 ± 0,95 mV. Se preparó una solución madre de HOCl ligeramente ácida mediante la disolución de NaDCC en 1 litro de agua desionizada, produciendo una concentración de FC de 201 ± 13,55 mg L-1, con un pH de 5,6 ± 0,25 y un ORP medio de +958 ± 18,98 mV. ECAS se generó mediante la electrólisis de una solución de NaCl utilizando un generador electroquímico de 60 L/h suministrado por Bridge Biotechnology Ltd (Fife, Escocia, Reino Unido). Se generaron soluciones de ECAS con concentraciones de FC de 158,63 ± 18,66 mg L-1, pH medio de 3,3 ± 0,16 y ORP de +1134 ± 3,26 mV, que se almacenaron a 4 °C en la oscuridad y se utilizaron dentro de los 5 días posteriores a la producción. Todas las soluciones desinfectantes se diluyeron con agua desionizada para producir concentraciones de FC equivalentes estandarizadas según lo determinado por el sulfato de N, N-dietil-p-fenilendiamina (DPD) no. 1 Prueba Palintest (Palintest Ltd., Gateshead, Reino Unido). El pH y el ORP de las soluciones se midieron utilizando un Orion Dual Star (Fisher Scientific, Reino Unido).

E. coli ATCC 10536 y P. aeruginosa ATCC 15422 se cultivaron en agar triptona de soja (TSA [Oxoid, Thermo Scientific, Reino Unido]) durante 24 h a 37 °C recuperados de reservas congeladas almacenadas a -80 °C.

Los ensayos de suspensión estándar para determinar la actividad bactericida de NaOCl, HOCl y ECAS contra E. coli se llevaron a cabo de acuerdo con BS EN 1040 (41British Standards Institution, 2005) y BS EN 1276 (42British Standards Institution, 2009). Se utilizaron concentraciones de FC estandarizadas de 25, 50, 100 y 150 mg L-1 como regímenes de tratamiento para cada uno de los desinfectantes de prueba (ver Sección 4.1).

Según los ensayos estándar BS EN 1040/1276, las suspensiones bacterianas de E. coli dentro de una solución diluyente (1 g L-1 de triptona y 8,5 g L-1 de NaCl) se estandarizaron mediante densidad óptica (OD620 nm) a 8,54 ± 0,27 log10 UFC mL- 1. Cuando fue necesario, se prepararon soluciones inhibidoras de (BSA) en dos concentraciones disolviendo 0,3 g 100 ml-1 (limpio) y 3,0 g 100 ml-1 (sucio) de BSA, luego se esterilizaron por filtración a través de filtros de jeringa de 0,45 µm (jeringa Sartorius Minisart®). filtros). Esto dio como resultado concentraciones de BSA del ensayo final de 0,3 g L-1 (limpio) y 3,0 g L-1 (sucio).

El ensayo se realizó mezclando 1 ml de suspensión de prueba de E. coli con 1 ml de solución inhibidora (ya sea DI estéril, BSA limpia o sucia) y 8 ml de desinfectante de prueba (NaOCl, HOCl o ECAS), durante el tiempo de contacto especificado. de 5 min a 20 °C. Posteriormente, se pipeteó inmediatamente una muestra de 1 ml del vial de reacción (que comprende la suspensión de prueba, la solución inhibidora y el desinfectante de prueba) en 9 ml de una solución neutralizante validada (5 g L-1 de tiosulfato de sodio y 27,5 g L-1 de caldo Letheen; BD Difco, Becton Dickinson). Las muestras neutralizadas se diluyeron en serie en DI estéril y se sembraron por duplicado en TSA (volumen de 50 µl) utilizando un plateador en espiral automatizado Whitley ([WASP] Don Whitley Scientific, Shipley, Reino Unido). Luego se incubaron a 37 °C durante 24 h y se contaron las colonias resultantes (expresadas como UFC por ml).

Se utilizó el reactor de biopelículas del Centro para el Control de Enfermedades [CDC] (ver Fig. 5);64 para cultivar y probar biopelículas de P. aeruginosa en cupones de PC (BioSurfaces Technologies, EE. UU.). Se utilizaron concentraciones de FC estandarizadas de 5, 25, 50, 75, 100 y 150 mg L-1 como regímenes de tratamiento para cada uno de los desinfectantes de prueba (ver Sección 2.1).

Configuración experimental estándar del reactor de biopelícula CDC. El medio de entrada estéril (es decir, caldo de triptona y soja) se mantiene dentro de una bombona Nalgene™ de 20 L [1] y se extrae a través de una bomba peristáltica de un solo canal [2] hacia el reactor de biopelícula CDC [3]. Una placa agitadora calefactora [4] mantuvo constante la temperatura y la fuerza de corte dentro del reactor CDC. Una bombona de residuos estéril Nalgene™ recoge los residuos del reactor de biopelículas de los CDC [5].

El inóculo de P. aeruginosa se cultivó en 100 ml de caldo de triptona de soja con 100 mg L-1 (TSB [CM0129; Oxoid, Thermo Scientific, Reino Unido]) dentro de una incubadora con agitación durante 24 h a 35 °C a 150 rpm, lo que resultó en un densidad microbiana final de 7,79 ± 0,17 log10 UFC mL-1 (n = 9). Se añadió medio estéril (330 ml de TSB 100 mg L-1) a un reactor CDC estéril que contenía varillas de cupón, que albergaban 3 cupones de PC por varilla (n = 8 varillas por reactor). El reactor CDC se colocó en una placa de agitación calentada (ajustada a 22,5 °C y agitada continuamente a 125 rpm), se añadió 1 ml de inóculo de P. aeruginosa y se incubó durante 24 h (la fase discontinua), permitiendo que las bacterias se unieran y establecieran. biopelículas en los cupones de PC (contenidos dentro de las varillas de extracción). Posteriormente, se introdujo en el reactor CDC la adición continua de medio estéril (100 mg L-1 TSB), extraído de una bombona estéril esterilizable en autoclave de 20 L (Nalgene™ 2250-0050; Fisher Scientific, Reino Unido), a un caudal de 11 ml. min-1 durante 24 h adicionales. El volumen dentro del reactor CDC durante este período se mantuvo mediante un vertedero de desbordamiento conectado a una bombona de medios residuales. Este método dio como resultado biopelículas de cupón de PC de P. aeruginosa reproducibles con una densidad de 8,45 ± 0,172 log10 cupón de UFC-1 (n = 18) y, por lo tanto, adecuadas para experimentaciones posteriores.

Para permitir la evaluación de la actividad antimicrobiana de los desinfectantes de prueba, se retiraron asépticamente biopelículas de cupón de PC de P. aeruginosa del reactor CDC y se colocaron en tubos Falcon de 50 ml, que contenían 3 ml de desinfectante de prueba o DI estéril (control). Después de un tiempo de contacto de 5 minutos a temperatura ambiente, se agregaron 27 ml de solución neutralizante validada (5 g L-1 de tiosulfato de sodio y 27,5 g L-1 de caldo Letheen) a todas las muestras y se dejaron durante 10 minutos más a temperatura ambiente. Posteriormente, para eliminar la biopelícula de la superficie de los cupones de PC, cada tubo Falcon se agitó durante 30 segundos y luego se colocó en un baño de agua con ultrasonidos (FB11078 FisherBrand) durante 1 minuto; esto se repitió tres veces en total. Las células de biopelícula desagregadas se diluyeron en serie en solución de Ringer de un cuarto de concentración (Oxoid, Fisher Scientific, Reino Unido) y se sembraron en espiral sobre agar R2A (Oxoid, Thermo Scientific, Reino Unido). Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h y las colonias resultantes se contaron y expresaron como UFC por cupón.

Los valores CT son el producto de la concentración de un desinfectante (por ejemplo, cloro activo libre) y el tiempo de contacto con el agua que se está desinfectando. Se calcularon los valores de CT para la reducción de 5 log (99,999 %) de E. coli planctónica y la reducción de 2 log (99 %) de la biopelícula de P. aeruginosa mediante regresión lineal, con un tiempo de contacto de 5 min a temperatura ambiente (20 –22,5 °C), y ajustado para expresarse como mg/min L-1.

Para los conjuntos de datos de ensayos bactericidas y de biopelículas, se utilizó un análisis de varianza bidireccional (ANOVA) con la prueba posterior de Tukey para determinar diferencias significativas entre el tipo de desinfectante y la concentración de FC (GraphPad Prism versión 7.0 para Windows, San Diego, CA) . Se consideró significativo un valor de AP < 0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Este estudio fue financiado por el Consejo de Investigación del Medio Ambiente Natural, Reino Unido [NE/R003106/1], la Universidad del Oeste de Inglaterra, Bristol y Portsmouth Aviation Ltd.

Centro de Investigación en Biociencias, Universidad del Oeste de Inglaterra, Bristol, BS16 1QY, Reino Unido

Gillian E. Clayton, Robin MS Thorn y Darren M. Reynolds

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GEC: desarrollo de métodos experimentales, trabajo experimental, recopilación y análisis de datos, preparación y redacción de manuscritos, revisión y edición. RMST: adquisición de financiación, conceptualización y desarrollo experimental, supervisión de proyectos y revisión y edición de manuscritos. DMR: adquisición de financiación, conceptualización y desarrollo experimental, supervisión de proyectos y revisión y edición de manuscritos.

Correspondencia a Darren M. Reynolds.

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

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Clayton, GE, Thorn, RMS y Reynolds, DM La eficacia de los desinfectantes a base de cloro contra las bacterias planctónicas y de biopelículas para el agua potable en el punto de uso descentralizado. npj Agua Limpia 4, 48 (2021). https://doi.org/10.1038/s41545-021-00139-w

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Recibido: 09 de julio de 2021

Aceptado: 08 de octubre de 2021

Publicado: 04 de noviembre de 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41545-021-00139-w

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